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缬沙坦对糖尿病大鼠视网膜组织NFκB表达影响
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作者：冀鹏飞,周占宇,李松涛,付浴东 作者单位：青岛大学医学院附属医院眼科
【摘要】 目的探讨缬沙坦对糖尿病大鼠视网膜组织核因子κB(NFκB)表达的影响。方法 将20只Wistar大鼠随机分为正常对照组、高糖诱导视网膜病变模型组、缬沙坦处理组和缓冲液处理组，每组5只大鼠。正常对照组和模型组不做处理,缬沙坦组给予缬沙坦40 mg/kg灌胃, 缓冲液组给予相同体积缓冲液灌胃，用免疫组织化学法检测视网膜组织中NFκB的表达水平。结果 正常对照组大鼠视网膜组织NFκB无阳性表达，模型组、缬沙坦组、缓冲液组NFκB表达水平均明显高于正常对照组(F=262.00，q=18.06～34.59，P<0.01);缬沙坦组NFκB表达水平较模型组明显降低(q=15.29，P<0.01)。结论 缬沙坦能降低大鼠视网膜组织中NFκB表达水平，对糖尿病大鼠视网膜病变具有保护作用。
【关键词】 缬沙坦;糖尿病视网膜病变;NFκB;细胞凋亡;大鼠
EFFECT OF VALSARTAN ON RETINA NFκB EXPRESSION IN DIABETIC RATS
JI PENGFEI, ZHOU ZHANYU, LI SONGTAO, et al
(Department of Ophthalmology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);
[ABSTRACT] Objective To observe the effect of Valsartan on NFκB expression in retina of diabetic rats. MethodsTwenty Wistar rats were equally randomized to four groups:control group,highglucoseinduced retinopathy (HGIR) group, buffer group and Valsartan group. The control group and HGIR group received no therapy. The mice in Valsartan group were given Valsartan (40 mg/kg) intragastrically. Those in buffer group were given the same volume of buffer as Valsartan group intragastrically. The expression of NFκB in retinal tissue was examined immunohistochemically. Results There was no expression of NFκB in normal retina tissue. The expression of NFκB in the other three groups was significantly higher than the control group (F=262.00;q=18.06-34.59;P<0.01), while the NFκB expression in Valsartan group was significantly lower than that of the HGIR group (q=15.29,P<0.01). Conclusion Valsartan provided potential protection against retinopathy in diabetic rats via reducing NFκB expression of retinal tissue.
[KEY WORDS] Valsartan; diabetic retinopathy; NFkappa B; apoptosis; rats
糖尿病视网膜病变(DR)是由于体内血糖过高而引起的视网膜的微血管病变，由于视网膜组织的低氧、新生血管的形成，最终导致视功能不可逆的损害。随着研究的不断深入，许多学者发现，核因子κB (NFκB)在许多低氧性视网膜疾病的发生、发展中起着重要作用[13]。NFκB是一种具有多向性调节作用的蛋白质因子，它广泛参与体内的炎症、免疫、细胞凋亡、肿瘤等疾病的发生发展过程。有研究结果显示，活性氧(ROS)是诱导NFκB表达的重要因素之一[4]。 缬沙坦为血管紧张素Ⅱ受体1(ATⅠ)拮抗剂，可竞争性拮抗血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)。有研究结果表明，AngⅡ通过激活ATⅠ引起 ROS生成增多[5]。本实验主要通过建立高糖诱导视网膜病变大鼠模型，观察缬沙坦对NFκB表达的影响，初步探讨该药对高糖模型大鼠视网膜是否有保护作用。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
健康雄性Wistar大鼠20只(青岛大学医学院动物实验中心提供)，体质量为220～240 g，自由饮食,室温饲养。主要试剂与药物为兔抗大鼠NFκB免疫组织化学试剂盒(美国Santa Cruz公司提供)，缬沙坦(北京诺华公司产品)，链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司产品)，One Touch血糖仪(美国强生公司产品)。
1.2 糖尿病大鼠模型的建立及分组
将20只Wistar大鼠随机分为正常对照组、高糖诱导视网膜病变模型组、缬沙坦处理组和缓冲液处理组，每组5只大鼠。后3组大鼠于第4周末禁食12 h后一次性腹腔注射100 mg/kg的STZ (用新鲜配制的pH 值为4.4 的0.1 mol/L枸橼酸缓冲液配制),24～48 h后取尾血测血糖，血糖>16.65 mmol/L者为造模成功。成模后每周检测 1次体质量和饮水量,每月检测 1次血糖。正常对照组和模型组不予任何处理，缬沙坦组每日以缬沙坦40 mg/kg灌胃, 缓冲液组给予等容积的缓冲液灌胃。
1.3 取材与固定
于第12周以过量戊巴比妥钠麻醉处死大鼠,立即摘除双侧眼球固定，梯度乙醇脱水,剪开眼球壁,去除眼前节和玻璃体,以睫状后长动脉为参考将视网膜做放射状切开，二甲苯透明,浸蜡,包埋，将平行于视神经矢状轴且避开视盘周围的视网膜进行连续切片,厚度约4 μm，每个标本切10张切片，相邻2张切片间隔12 μm。
1.4 NFκB的免疫组化检测
组织切片脱蜡，水化，冲洗，H2O2灭活内源性过氧化物酶，缓冲液处理后加抗原修复液Ⅰ修复抗原。正常血清封闭液室温处理后滴加NFκB抗体，4 ℃过夜。复温后滴加兔抗鼠IgG二抗，SABC法染色，DAB显色，苏木精轻度复染，二甲苯透明，中性树脂封片，细胞核染为棕黄色或棕褐色为阳性。应用Simple PCI医学图像分析系统，对视网膜组织中NFκB染色强度进行目标灰度测定，以灰度值代表NFκB表达的强弱(灰度值越大提示表达越弱)，测定结果以平均灰度值表示。
1.5 统计学分析
采用 SPSS 10.0及PPMS 1.5[6]统计学软件进行分析,多组间比较采用单因素方差分析。
2 结果
正常对照组大鼠视网膜组织内无NFκB阳性表达，未见黄色染色颗粒，NFκB蛋白灰度值高。模型组大鼠NFκB主要分布于视网膜内核层和神经节细胞的胞质及胞核内，染色呈棕黄色，NFκB蛋白灰度值低。缬沙坦组大鼠NFκB主要分布于视网膜内核层和神经节细胞的胞质及胞核内，染色呈棕黄色，NFκB蛋白灰度值较高。缓冲液组大鼠NFκB主要分布于视网膜内核层和神经节细胞的胞质及胞核内，染色呈棕黄色，NFκB蛋白灰度值低。正常对照组、模型组、缬沙坦组、缓冲液组大鼠NFκB表达水平分别为173.26±5.73、132.49±6.28、151.18±4.51、130.97±5.19，后3组均较正常对照组增高(F=262.00，q=18.06～34.59，P<0.01)，缬沙坦组NFκB表达水平较模型组明显降低(q=15.29，P<0.01)。
3 讨论
长期高糖血症能诱导视网膜毛细血管周细胞凋亡，早期发生在毛细血管，后逐渐发生到小动脉，由于血管周细胞数量的下降，使血管通透性增加，血管间质水肿;同时减弱了其对内皮细胞的接触性抑制作用，引起血管基膜增厚、继而导致管腔狭窄或闭塞，形成微血管瘤，进一步发展则出现视网膜硬性渗出、棉绒斑、视网膜出血、新生血管和纤维组织的增生，最终导致牵引性视网膜脱离。
NFκB又称κ基因结合核因子，是广泛存在于细胞中的具有多向性调节作用的蛋白质分子，它首先在1986年从B淋巴细胞的提取物中检测到[7]，因最先发现其结合部位位于编码B细胞免疫球蛋白κ轻链基因的增强子中而得名。NFκB是一类参与一系列基因表达调控的关键性核转录因子，它通常以二聚体形式与核因子抑制蛋白(IKB)结合呈无活性状态存在于多种细胞的胞浆中，多种不同的刺激因素(如炎症、细胞因子、病毒、紫外线、ROS等)可促使NFκB表达活化，并参与细胞生长、分化、黏附、凋亡及炎症等反应。
研究证实，当体内长期出现血糖紊乱时，可导致肾素血管紧张素系统(RAS)活性增高，组织中Ang Ⅱ含量增加，从而使ROS的合成增加，ROS可通过激活丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号传导通路，使IKB磷酸化而被降解，从而与NFκB分离，周细胞内NFκB被激活，促凋亡因子Bax过度表达，引起周细胞凋亡、血视网膜屏障破坏，视网膜毛细血管通透性增高[7]。本文结果显示，高糖诱导视网膜病变模型组12周时视网膜组织NFκB的表达较正常对照组显著增高(P<0.01)，证明高糖血症促进了NFκB过度表达。MAMPUTU等[8]研究证实，高糖血症时NFκB被激活，它能正向调节VEGF mRNA及其蛋白表达，而VEGF又能增强NFκB的结合能力，增加视网膜内皮细胞的增殖，它们共同促进新生血管的形成，最终导致视功能损害等，因此推测可能高糖诱导视网膜病变的发生与视网膜表达的NFκB增加了VEGF的表达也有关。
缬沙坦是ATⅠ受体拮抗剂，它对ATⅠ有高度选择性、专一性和高亲和力，可竞争性拮抗Ang Ⅱ。它通过结合ATⅠ，阻断RAS，从而减少ROS含量，改善氧化应激，进而降低NFκB表达，抑制VEGF表达。本文结果显示，缬沙坦组大鼠视网膜内NFκB的表达较模型组显著降低(P<0.01)，推测缬沙坦通过降低DR大鼠视网膜内NFκB的表达，抑制了视网膜组织VEGF的表达，延缓了DR的发展。但缬沙坦并未完全阻断NFκB表达,这是因为视网膜局部 RAS激活不是DR发生发展的惟一机制,氧化应激、蛋白非酶糖基化终产物的异常沉积等因素也起着一定的作用[9]。
总之,本实验证明了缬沙坦能够降低高糖血症时视网膜组织NFκB的表达，从而延缓了DR的发展，为治疗DR提供了新的思路，但其中的具体机制还不是太清楚，仍需进一步研究。
【参考文献】
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