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  • 缬沙坦对糖尿病大鼠视网膜组织NFκB表达影响
  • 浏览 4183 次 【字号 】 发布日期:[ 2012-6-8 ]

  • 作者:冀鹏飞,周占宇,李松涛,付浴东  作者单位:青岛大学医学院附属医院眼科

      【摘要】  目的探讨缬沙坦对糖尿病大鼠视网膜组织核因子κB(NFκB)表达的影响。方法 将20只Wistar大鼠随机分为正常对照组、高糖诱导视网膜病变模型组、缬沙坦处理组和缓冲液处理组,每组5只大鼠。正常对照组和模型组不做处理,缬沙坦组给予缬沙坦40 mg/kg灌胃, 缓冲液组给予相同体积缓冲液灌胃,用免疫组织化学法检测视网膜组织中NFκB的表达水平。结果 正常对照组大鼠视网膜组织NFκB无阳性表达,模型组、缬沙坦组、缓冲液组NFκB表达水平均明显高于正常对照组(F=262.00,q=18.06~34.59,P<0.01);缬沙坦组NFκB表达水平较模型组明显降低(q=15.29,P<0.01)。结论 缬沙坦能降低大鼠视网膜组织中NFκB表达水平,对糖尿病大鼠视网膜病变具有保护作用。

      【关键词】 缬沙坦;糖尿病视网膜病变;NFκB;细胞凋亡;大鼠

      EFFECT OF VALSARTAN ON RETINA NFκB EXPRESSION IN DIABETIC RATS

      JI PENGFEI, ZHOU ZHANYU, LI SONGTAO, et al

      (Department of Ophthalmology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);

      [ABSTRACT] Objective To observe the effect of Valsartan on NFκB expression in retina of diabetic rats. MethodsTwenty Wistar rats were equally randomized to four groups:control group,highglucoseinduced retinopathy (HGIR) group, buffer group and Valsartan group. The control group and HGIR group received no therapy. The mice in Valsartan group were given Valsartan (40 mg/kg) intragastrically. Those in buffer group were given the same volume of buffer as Valsartan group intragastrically. The expression of NFκB in retinal tissue was examined immunohistochemically. Results There was no expression of NFκB in normal retina tissue. The expression of NFκB in the other three groups was significantly higher than the control group (F=262.00;q=18.06-34.59;P<0.01), while the NFκB expression in Valsartan group was significantly lower than that of the HGIR group (q=15.29,P<0.01). Conclusion Valsartan provided potential protection against retinopathy in diabetic rats via reducing NFκB expression of retinal tissue.

      [KEY WORDS] Valsartan; diabetic retinopathy; NFkappa B; apoptosis; rats

      糖尿病视网膜病变(DR)是由于体内血糖过高而引起的视网膜的微血管病变,由于视网膜组织的低氧、新生血管的形成,最终导致视功能不可逆的损害。随着研究的不断深入,许多学者发现,核因子κB (NFκB)在许多低氧性视网膜疾病的发生、发展中起着重要作用[13]。NFκB是一种具有多向性调节作用的蛋白质因子,它广泛参与体内的炎症、免疫、细胞凋亡、肿瘤等疾病的发生发展过程。有研究结果显示,活性氧(ROS)是诱导NFκB表达的重要因素之一[4]。 缬沙坦为血管紧张素Ⅱ受体1(ATⅠ)拮抗剂,可竞争性拮抗血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)。有研究结果表明,AngⅡ通过激活ATⅠ引起 ROS生成增多[5]。本实验主要通过建立高糖诱导视网膜病变大鼠模型,观察缬沙坦对NFκB表达的影响,初步探讨该药对高糖模型大鼠视网膜是否有保护作用。现将结果报告如下。

      1 材料与方法

      1.1 材料

      健康雄性Wistar大鼠20只(青岛大学医学院动物实验中心提供),体质量为220~240 g,自由饮食,室温饲养。主要试剂与药物为兔抗大鼠NFκB免疫组织化学试剂盒(美国Santa Cruz公司提供),缬沙坦(北京诺华公司产品),链脲佐菌素(STZ,美国Sigma公司产品),One Touch血糖仪(美国强生公司产品)。

      1.2 糖尿病大鼠模型的建立及分组

      将20只Wistar大鼠随机分为正常对照组、高糖诱导视网膜病变模型组、缬沙坦处理组和缓冲液处理组,每组5只大鼠。后3组大鼠于第4周末禁食12 h后一次性腹腔注射100 mg/kg的STZ (用新鲜配制的pH 值为4.4 的0.1 mol/L枸橼酸缓冲液配制),24~48 h后取尾血测血糖,血糖>16.65 mmol/L者为造模成功。成模后每周检测 1次体质量和饮水量,每月检测 1次血糖。正常对照组和模型组不予任何处理,缬沙坦组每日以缬沙坦40 mg/kg灌胃, 缓冲液组给予等容积的缓冲液灌胃。

      1.3 取材与固定

      于第12周以过量戊巴比妥钠麻醉处死大鼠,立即摘除双侧眼球固定,梯度乙醇脱水,剪开眼球壁,去除眼前节和玻璃体,以睫状后长动脉为参考将视网膜做放射状切开,二甲苯透明,浸蜡,包埋,将平行于视神经矢状轴且避开视盘周围的视网膜进行连续切片,厚度约4 μm,每个标本切10张切片,相邻2张切片间隔12 μm。

      1.4 NFκB的免疫组化检测

      组织切片脱蜡,水化,冲洗,H2O2灭活内源性过氧化物酶,缓冲液处理后加抗原修复液Ⅰ修复抗原。正常血清封闭液室温处理后滴加NFκB抗体,4 ℃过夜。复温后滴加兔抗鼠IgG二抗,SABC法染色,DAB显色,苏木精轻度复染,二甲苯透明,中性树脂封片,细胞核染为棕黄色或棕褐色为阳性。应用Simple PCI医学图像分析系统,对视网膜组织中NFκB染色强度进行目标灰度测定,以灰度值代表NFκB表达的强弱(灰度值越大提示表达越弱),测定结果以平均灰度值表示。

      1.5 统计学分析

      采用 SPSS 10.0及PPMS 1.5[6]统计学软件进行分析,多组间比较采用单因素方差分析。

      2 结果

      正常对照组大鼠视网膜组织内无NFκB阳性表达,未见黄色染色颗粒,NFκB蛋白灰度值高。模型组大鼠NFκB主要分布于视网膜内核层和神经节细胞的胞质及胞核内,染色呈棕黄色,NFκB蛋白灰度值低。缬沙坦组大鼠NFκB主要分布于视网膜内核层和神经节细胞的胞质及胞核内,染色呈棕黄色,NFκB蛋白灰度值较高。缓冲液组大鼠NFκB主要分布于视网膜内核层和神经节细胞的胞质及胞核内,染色呈棕黄色,NFκB蛋白灰度值低。正常对照组、模型组、缬沙坦组、缓冲液组大鼠NFκB表达水平分别为173.26±5.73、132.49±6.28、151.18±4.51、130.97±5.19,后3组均较正常对照组增高(F=262.00,q=18.06~34.59,P<0.01),缬沙坦组NFκB表达水平较模型组明显降低(q=15.29,P<0.01)。

      3 讨论

      长期高糖血症能诱导视网膜毛细血管周细胞凋亡,早期发生在毛细血管,后逐渐发生到小动脉,由于血管周细胞数量的下降,使血管通透性增加,血管间质水肿;同时减弱了其对内皮细胞的接触性抑制作用,引起血管基膜增厚、继而导致管腔狭窄或闭塞,形成微血管瘤,进一步发展则出现视网膜硬性渗出、棉绒斑、视网膜出血、新生血管和纤维组织的增生,最终导致牵引性视网膜脱离。

      NFκB又称κ基因结合核因子,是广泛存在于细胞中的具有多向性调节作用的蛋白质分子,它首先在1986年从B淋巴细胞的提取物中检测到[7],因最先发现其结合部位位于编码B细胞免疫球蛋白κ轻链基因的增强子中而得名。NFκB是一类参与一系列基因表达调控的关键性核转录因子,它通常以二聚体形式与核因子抑制蛋白(IKB)结合呈无活性状态存在于多种细胞的胞浆中,多种不同的刺激因素(如炎症、细胞因子、病毒、紫外线、ROS等)可促使NFκB表达活化,并参与细胞生长、分化、黏附、凋亡及炎症等反应。

      研究证实,当体内长期出现血糖紊乱时,可导致肾素血管紧张素系统(RAS)活性增高,组织中Ang Ⅱ含量增加,从而使ROS的合成增加,ROS可通过激活丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号传导通路,使IKB磷酸化而被降解,从而与NFκB分离,周细胞内NFκB被激活,促凋亡因子Bax过度表达,引起周细胞凋亡、血视网膜屏障破坏,视网膜毛细血管通透性增高[7]。本文结果显示,高糖诱导视网膜病变模型组12周时视网膜组织NFκB的表达较正常对照组显著增高(P<0.01),证明高糖血症促进了NFκB过度表达。MAMPUTU等[8]研究证实,高糖血症时NFκB被激活,它能正向调节VEGF mRNA及其蛋白表达,而VEGF又能增强NFκB的结合能力,增加视网膜内皮细胞的增殖,它们共同促进新生血管的形成,最终导致视功能损害等,因此推测可能高糖诱导视网膜病变的发生与视网膜表达的NFκB增加了VEGF的表达也有关。

      缬沙坦是ATⅠ受体拮抗剂,它对ATⅠ有高度选择性、专一性和高亲和力,可竞争性拮抗Ang Ⅱ。它通过结合ATⅠ,阻断RAS,从而减少ROS含量,改善氧化应激,进而降低NFκB表达,抑制VEGF表达。本文结果显示,缬沙坦组大鼠视网膜内NFκB的表达较模型组显著降低(P<0.01),推测缬沙坦通过降低DR大鼠视网膜内NFκB的表达,抑制了视网膜组织VEGF的表达,延缓了DR的发展。但缬沙坦并未完全阻断NFκB表达,这是因为视网膜局部 RAS激活不是DR发生发展的惟一机制,氧化应激、蛋白非酶糖基化终产物的异常沉积等因素也起着一定的作用[9]。

      总之,本实验证明了缬沙坦能够降低高糖血症时视网膜组织NFκB的表达,从而延缓了DR的发展,为治疗DR提供了新的思路,但其中的具体机制还不是太清楚,仍需进一步研究。

      【参考文献】

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