·设为首页 ·收藏本站业务电话:15812469196，020-22926644  业务QQ:点击这里给我发消息QQ交谈 点击这里给我发消息QQ交谈  业务邮箱:654985325@qq.com
网站公告： 2018年职称评审开始了，论文好网一如既往服务于你们，并给与最大优惠。
传染病论文
您当前的位置：首页 - 传染病论文
  • comHLAA2限制性CTL表位HPV18E7715分子修饰肽的免疫原性鉴定
  • 浏览 1500 次　【字号 大 中 小】　发布日期：[ 2012-4-11 ]
  • 作者：论文好网编辑部

    　　【摘要】 目的：对HLAA2限制性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位HPV18E7715进行氨基酸置换修饰,探讨修饰肽的免疫原性。方法：采用细胞毒实验(51Cr释放法)，以包被了九肽的T2细胞作为靶细胞，以九肽诱导的HLAA2阳性人外周血单个核细胞为效应细胞，观察目标肽是否具有诱导特异性CTL杀伤效应。结果：修饰肽符合HLAA2分子限制性细胞毒性T细胞的表位要求，具有特异性细胞毒性T细胞诱导活性。结论：修饰肽具有较强的抗原性，可以作为高危型HPV感染治疗性肽疫苗分子设计的候选表位。

    　　【关键词】 人乳头状瘤病毒 E7抗原 表位 HLAA2 CTL 免疫原性 分子修饰

    　　Abstract Objective:To investigate the immunogenicity of peptide modified by amino acid substitution for the cytotoxic T lymphocytes (CTLs) epitope HPV18E7715 restricted by HLAA2.Methods:51Cr release assay was used to determine their abilities of inducing the generation of specific CTLs.Results:The modified peptide TLQDIVLHV met the requirements of HLAA2restricted CTL epitopes and had the abilitiy of inducing the generation of specific CTLs.Conclusion:The modified peptide TLQDIVLHV may have better antigenicity and affinity to HLAA2,and can be used as one of the HLAA2 restricted candidate epitopes for therapeutic peptide vaccine against HPV infection.

    　　Key words papillomavirus,human E7 antigen epitopes HLAA2 cytotoxic Tlymphocyte molecular modification

    　　高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的16型、18型感染可导致尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤和宫颈癌等疾病[1]。该病毒基因组依据其功能的活动时段不同可分为3个编码区，其中早期区(early region，E区)分别编码E1、E2、E4、E5、E6、E7六个早期蛋白，主要参与病毒DNA的复制、维持细胞内HPV拷贝数、以及转录和翻译调控等功能。病变及周围组织大多可以持续检测到HPV E7蛋白的表达，以该蛋白为靶抗原的人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)A2分子限制性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位的筛选和鉴定具有重要意义，也是这类疾病治疗性肽疫苗研究的传统思路和热点所在[2]。在针对靶抗原E7蛋白的治疗性疫苗研究方面，为了确定与CTL的T细胞抗原受体(T cell antigen receptor，TCR)或靶细胞表面主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类分子具有高亲和力的表位，对表位进行氨基酸置换修饰[3]，修饰后可以有效提高表位结合力同时保持抗原特异性的新表位具有重要意义[4]。本研究探讨对HPV18E7715进行氨基酸置换修饰后修饰肽的免疫原性。

    　　1 材料与方法

    　　1.1 HPV18E7715修饰肽的制备 HPV18E77

    　　15 原有序列(TLQDIVLHL)第9位氨基酸L置换为V，则修饰肽序列改为(TLQDIVLHV)。

    　　1.2 修饰肽的免疫原性鉴定

    　　采用细胞毒实验(51Cr释放法)。以包被了九肽的T2细胞作为靶细胞，以九肽诱导的HLAA2阳性人外周血单个核细胞为效应细胞，观察目标肽是否具有诱导特异性CTL杀伤效应。

    　　1.3 靶细胞的制备

    　　取生长良好的T2淋巴细胞，RPMI 1640培养液离心洗涤2次，使用前用各多肽包被并孵育4小时,每106 T2细胞加入多肽10μg。

    　　1.4 效应细胞

    　　取HLAA2健康献血者静脉血200ml,采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞PBMC，并分装6个培养瓶进行培养,用10%FCSRPMI 1640培养液调细胞浓度为1×106/ml，分别加入多肽和对照用无关肽,多肽质量浓度为10ug/ml,共3次刺激,每次间隔时间为1周,每次刺激前均需洗涤和重悬PBMC并加入白介素Ⅱ(每毫升加100U),最后1次刺激3天后收集效应细胞。

    　　1.5 靶细胞的标记

    　　孵育后每孔加入3700kBq Na51CrO4，37℃ 5%CO2孵育90min。用RPMI 1640培养液离心洗2次，收集标记的靶细胞，用10%FCSRPMI 1640培养液调细胞浓度至1×105/ml。

    　　1.6 测 定

    　　分别取效应细胞100μl，放射性核素标记的靶细胞50μl和抗CD3单克隆抗体50μl，加入96孔培养板中。同时设自然释放对照孔(靶细胞+10%FCSRPMI 1640培养液150μl)，最大释放对照孔(标记的靶细胞+2%Triton X100 150μl)和自然杀伤细胞活性对照孔(标记靶细胞+效应细胞),3复孔。室温，800r/min离心5min，37℃ 5%CO2孵育4小时。吸取培养上清液100μl，γ计数器测cpm值。

    　　检测的效靶比为5∶1，每组做3个复孔[5]，51Cr特异释放率为：(实验组γ脉冲数平均值-对照组γ脉冲数平均值)/(破坏的靶细胞组γ脉冲数平均值-对照组γ脉冲数平均值)。

    　　2 结 果

    　　细胞毒实验结果显示，修饰肽(TLQDIVLHV)和原有序列(TLQDIVLHL)均可以诱导特异性CTL杀伤效应，三组51Cr特异释放率分别为64.6%、72.2%和1.4%。修饰肽保留了修饰前的抗原特异性，对照肽无明显诱导活性，见图1。图1 51Cr特异释放率

    　　3 讨 论

    　　人体感染的HPV常见型别包括良性型HPV6、11型和恶性型HPV16、18型等。HPV感染后可导致尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤和宫颈癌等疾病，特别是恶性型HPV感染与宫颈癌的发生密切相关[6]。HPV基因组中E区可分为8个开放读码框，E7主要与细胞转化功能及致癌有关，作为靶抗原在研究中倍受重视[7]。虽然CTL在识别HPV抗原，特别是E7抗原和清除HPV感染中起重要作用， E7抗原可能含有与表位竞争结合的抑制性多肽序列，其结合力高于表位本身，但不具备相应的抗原性。因此，探讨E7抗原所包含的对表位起抑制作用的多肽序列，并据此对表位进行提高结合力的置换修饰，具有重要的临床意义。但是一旦进行氨基酸置换修饰，是否保留了原有的抗原性就有待进一步证实。本研究对HPV18E7715 原有序列(TLQDIVLHL)第9位氨基酸L置换为V后其修饰肽序列改为(TLQDIVLHV)进行免疫原性鉴定，目的是确定修饰肽在提高结合力的同时是否保留了原有的抗原特异性。

    　　本实验在抗原性鉴定上采用标准51Cr释放法，该方法缺点在于受同位素半衰期影响，不容易配合好效应细胞和靶细胞的培养时间。因此，在细胞培养前，研究者首先确定同位素到达的准确时间，之后再开始后续实验。实验结果表明，本次置换后的序列(TLQDIVLHV)和原有序列(TLQDIVLHL)均可以诱导特异性CTL杀伤效应，修饰肽保留了修饰前的抗原特异性，对照肽则无明显诱导活性。因此，可以考虑将修饰肽作为肽疫苗的候选表位之一[8]。

    　　【参考文献】

    　　\[1\] Smahel M,Tejklova P,Smahelova J,et al.Mutation in the immunodominant epitope of the HPV16 E7 oncoprotein as a mechanism of tumor escape\[J\].Cancer Immunol Immunother,2008,57(6):823831.

    　　\[2\] Nilres K,Hohn H,Pilch H,et al.Human papillomavirus type 16E7 peptidedirected CD8 T cells front patients with cervical cancer are crossreactive with the corenavirus NS2 protein\[J\].J Viml,2003,77(9):54645474.

    　　\[3\] Khan MJ,Castle PE,Lorinez AT,et al.The elevated 10year risk of cervical precancer and cancer in women with human papillomavirus(HPV) type 16 or 18 and the possible utility of typespecific HPV testing in clinical practice\[J\].J Natl Cancer Inst,2005,97(14):10721079.

    　　\[4\] 欧荣英，徐云升，林治华，等.十肽表位HPV16E71120氨基酸置换修饰的研究\[J\].中华微生物与免疫学杂志，2006，26(11)：990993.

    　　\[5\] Wiethe C,Dittmar K,Doan T,et al.Provisionof 41BB ligand enhances effector and memory CTL responses generated by immunization with dendritic cells expressing a human tumorassociated antigen\[J\].J Immunol,2003,170(6):29122922.

    　　\[6\] 田启龙.穿刺置疣术治疗尖锐湿疣97例对比观察\[J\].中国艾滋病性病，2009，15(1)：77.

    　　\[7\] Hung CF,Monie A,Alvarez RD,et al.DNA vaccines for cervical cancer:from bench to bedside\[J\].Exp Mol Med,2007,39(6):679689.

    　　\[8\] Lowy DR,Schiller JT.Prophylactic human papillomavirus vaccines \[J\].J Clin Invest,2006,116(5):l1671173本文转载于论文好网www.lunwenhao.com论文好网专业代写代发传染病学论文

业务电话：15812469196，020-22926644　业务QQ：点击这里给我发消息QQ交谈 点击这里给我发消息QQ交谈　业务邮箱：654985325@qq.com

CopyRight(C)2004-2020 广州文豪信息科技有限公司　粤ICP备14052946号-2

所有资料均源于网上的共享资源及期刊共享，请特别注意勿做其他非法用途。

如有侵犯您的版权或其他有损您利益的行为，请联系指出，论文好网会立即删除有关内容!