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摘要:目的建立反相高效液相色谱法测定清咽片中靛蓝的含量。方法采用AichromBondAQ C18色谱柱;甲醇水乙酸(64∶36∶0.5)为流动相,流速0.8 ml・min-1,紫外检测波长为285 nm。结果靛蓝可与其他主要成分分离,靛蓝与峰面积呈良好线性关系,线性范围在0.029 4~0.588 μg,回归方程为Y=26 644.73 X-1 288.56,r=0.999 9,样品平均回收率为99.51%,RSD=0.72%(n=6).结论该方法准确、快速、灵敏、重现性好。
关键词:清咽片; 靛蓝; 含量测定; 高效液相色谱
AbstractObjectiveTo establish a method using RP-HPLC for determination of the content of Indigo in Qingyan tablet.MethodsThe content of Indigo Naturalis was determined by reverse phase HPLC at 285nm on a AichromBond-AQ C18 column(4.6 mm×250 mm,5 μm)with methanol-water-acid(64∶36∶0.5) as mobile phase and flow rate of 0.8ml・min-1.ResultsThe linear range of calibration curve was 0.029 4~0.588μg(r=0.999 9),the average recovery was 99.51% with RSD of 0.72%(n=6).ConclusionThe method is simple,accurate and can be used for the quality study of Qingyan Tablet.
Key words:Qingyan Tablet; Indigo blue; Detemination; HPLC
清咽片是由桔梗、硼砂、寒水石、青黛、冰片、薄荷脑、诃子(去核)、甘草、甘草霜等中药组成的复方制剂。具有清凉解热、生津止渴之功效,用于咽喉肿痛、声嘶音哑、口干舌燥、咽下不利的治疗。青黛为
1 器材
岛津 LC-10AT高效液相色谱仪;岛津SPD-10A紫外检测器;2010双通道色谱工作站;KQ-250D数控超声波清洗器。靛蓝(indigo商品号:0756-200211)对照品由中国药品生物制品检定所提供,甲醇为色谱纯(美国 Fisher公司生产),氯仿为分析纯,水为重蒸水,清咽片由长春银诺克药业提供。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥24 h的靛蓝对照品适量,加氯仿制成每毫升含0.029 4 mg的溶液。
2.2 供试品溶液的制备取重量差异项下的本品20片,除去糖衣,研细,取2.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加氯仿25 ml,精密称定重量,超声处理1 h(每隔10 min振摇),取出放至室温,再称定重量,加氯仿补足减失的重量,过滤,滤液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。
2.3 色谱条件色谱柱为岛津公司产AichromBond-AQ C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm);以甲醇-水-乙酸(64∶36∶0.5)为流动相,流速0.8 ml・min-1,紫外检测波长为285 nm,理论板数按靛蓝峰计算应不低于3 000。
2.4 标准曲线的绘制精密吸取上述对照品溶液1,5,10,15,20 μl依照上述色谱条件进行分析,以进样体积(μl)为横坐标,以靛蓝的峰面积值为纵坐标,绘制标准曲线,计算得到的回归方程为:Y=26 644.73X-1 288.56,r=0.999 9;线性范围为0.029 4~0.588 μg。
2.5 精密度实验精密吸取同一供试品溶液20 μl,重复进样6次,测定靛蓝的峰面积,计算面积的RSD值为0.58%。
2.6 重现性实验取批号为20051001的清咽片适量,6份,除去糖衣后,研细,精密称定,按“2.2项”下的方法操作,制备供试品溶液,测定清咽片中靛蓝的含量,计算含量的RSD值为0.58%。
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2.7 稳定性实验分别精密吸取放置1,2,4,6,8 ,12 h的供试品溶液,测定清咽片中靛蓝的峰面积,计算峰面积的RSD值为0.77%,表明供试品溶液至少在12 h内稳定。
2.8 加样回收率实验精密称取靛蓝对照品适量,加入到已知靛蓝含量的清咽片(批号:20051001,靛蓝含量为0.0467%)中,按“2.2项”下方法操作,制备供试品溶液,测定清咽片中靛蓝的含量,结果靛蓝的平均回收率为99.51%,RSD为0.72%,n=5。
2.9 清咽片中靛蓝的含量测定按“2.2项”下方法操作,制备供试品溶液,测定10批清咽片中靛蓝的含量。结果见表1。
测定结果表明,清咽片中靛蓝含量基本稳定,故在平均含量的基础上,总含量上浮及下浮20%制定本制剂含量限度,限定每片含靛蓝的量不得低于0.11 mg。
3 讨论
3.1 2005年版《中国药典》采用紫外分光光度法测定靛蓝的含量,本实验采用高效液相法测定,操作简单,重现性好。通过全波长扫描得到靛蓝在285 nm处有最大吸收,因此选择285 nm为检测波长。
3.2 曾采用甲醇超声1 h,甲醇加热回流2 h,氯仿超声1 h,氯仿加热回流2 h 制备供试品溶液,结果发现,以甲醇为溶媒制备供试品溶液时,其它成分干扰较大,而且提取不完全;而以氯仿为提取溶媒时干扰成分少,提取完全,因此采用氯仿进行提取。在进行测定时发现,氯仿超声提取1 h与氯仿加热回流2 h,靛蓝的含量基本无差异,因此采用方便快捷的超声提取方法。
3.3 方法学考察表明:该含量测定方法操作简单,可行性强,重现性好。
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